双氯芬酸钠缓释微丸型片剂的制备及其药动学
双氯芬酸钠(diclofenac sodium，1) 属于第三代强效非甾体类抗炎药，通过抑制环氧合酶而减少花生素四烯酸的合成，从而缓解风湿、神经炎以及各种原因引起的发热和疼痛。但是1口服吸收快，生物半衰期短，仅为1.5～2h。1缓释片在国内外已上市多年，专利(中国，102525987A；中国，102846572A) 多以亲水性骨架材料羟丙甲纤维素(HPMC) 作缓释材料，制剂在12h内溶蚀并缓慢释药；另有专利( 中国, 1460470) 以生物膜骨架材料作载体制备缓释制剂，不仅保持了12h的缓释行为，也具有优良的生物相容性。本研究设计多单元缓释微丸片，将1缓释微丸和缓冲辅料混合后，压制成片剂，药物在胃肠道内可以迅速崩解为子单元，增加药物与胃肠道黏膜的接触面积，减少药物的刺激性；由于缓释作用体现于子单元，片剂可以被分割，因此提供了更加灵活的给药方案，弥补了上述专利报道中制剂不可分割的缺点；并且在工业生产上，制剂可分割可以使同一种药物避免申请2个规格的注册以及生产批件，减少了生产的物资消耗，利益得到最大化。由于这些独特的优点，多单元缓释微丸片成为了国内外研究的热点。
1 仪器与试药
TU-1950 型紫外-可见分光光度计( 北京普析通用仪器有限责任公司)；FiveEasy Plus实验室型pH计(瑞士Mettler Toledo公司)；Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；S-4800 型冷场发射扫描电镜(日本Hitachi 公司) ；KF-083 型溶出仪(美国安捷伦公司) ；GHL-7/5/3 型高速混合制粒机(常州佳发制粒干燥设备有限公司) ；CGC-30 型挤出滚圆机(挤出模具筛孔0.5 mm) 和WBF-2G 型多功能流化床(重庆英格造粒包衣技术有限公司) ；ZP-10型旋转式压片机(上海优译柯机械设备有限公司)；YD-2P型智能片剂硬度仪(天津大学无线电厂) ；FT-2000A 型片剂脆碎度仪(天津市天大天发科技有限公司) ；ZB-1C 型智能崩解仪(天津大学精密仪器厂)。
1 原料药( 安阳九州药业有限责任公司，含量99.6％，批号20140202009) ；1 缓释胶囊( 参比制剂，辅仁药业集团有限公司，规格50mg，批号201409218) ；EudragitNE30D( 德国赢创工业集团，批号20150614) ；滑石粉( 广西龙胜华美滑石开发有限公司，批号20160412) ；枸橼酸三乙酯( 蚌埠丰原涂山制药有限公司，批号20160823) ；微晶纤维素(MCC，规格101和PH200) 和HPMC( 规格E15和E50) ( 安徽山河药业辅料股份有限公司) ；一水乳糖( 德国美剂乐公司，批号20140312) ；硬脂酸( 上海昌为医药辅料技术有限公司，批号20160324) ；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
家兔[2～3kg，雌雄兼用，河南省动物实验中心，许可证编号SCXK( 豫)2016-0001]。
2 方法与结果
2.1 建立制剂中1 含量的测定方法
照中国药典2015 年版二部收录的1 制剂含量的测定方法确定色谱条件。色谱柱C18 柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相 甲醇∶4％冰乙酸(70∶30)；检测波长276nm；流速1ml/min；柱温30℃；进样量10μl。
标准曲线：称取已干燥的1 原料药100mg 置100ml 量瓶中，加入适量70％甲醇，振摇溶解并定容，作贮备液。用70％甲醇稀释成1浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5mg/ml的溶液。以1浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，线性回归，得标准曲线方程A=225.12c-3.741 7，R2=0.999 3，表明1 浓度在0.1～0.5mg/ml 范围内线性关系良好。
1 含量测定：取1 缓释微丸片5 片，研细后称取适量( 约相当于1 25 mg)，置100ml量瓶中，加入70％甲醇适量，振摇超声使1 溶解完全，用70％甲醇定容，摇匀，作供试品溶液。另精密称取1 原料药适量，加入70％甲醇溶解并定量稀释成0.25mg/ml的溶液，作对照品溶液，同法测定。以外标法计算制剂中1 的含量。
2.2 建立1 缓释微丸片的体外释放测定方法
以纯化水900ml作释放介质，在(37±0.5)℃、转速(50±1)r/min下试验，分别于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 和8h时取样10ml( 同时补充同温等量介质)，精密量取5ml 置10ml 量瓶中，加水稀释1倍，然后照紫外分光光度法在276nm下测定其吸光度。
精密称取1 原料药25mg，置100ml量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，精密量取5ml 置100ml 量瓶中，加水定容，作为对照品溶液。计算相应时间点样品中1 的浓度以及累积释放率(Q)。
2.3 1微丸的制备
预试验中以粒径、收率等为指标，考察了3 种常用填充剂( 淀粉、MCC 101 和一水乳糖)、不同黏合剂(HPMC E50 或E15 溶液)、不同滚圆速度(700、1000 和1300 r/min) 的影响。结果表明，采用MCC 101 和一水乳糖作填充剂、HPMC E15 浓度为0.2％的溶液作黏合剂、在1000 r/min 下滚圆5 min，所得微丸最终较少形成细粉，粒度差异较小，收率为83％，圆整度为1.03±0.29。因此，确定1微丸的制备工艺如下：将1、MCC 101 和一水乳糖以2∶3∶5 的质量比混合，加入总混物38.4％的HPMC E15 溶液( 浓度0.2％ ) 制备软材，置挤出滚圆机中挤出，在滚圆转速1000 r/min 条件下滚圆5 min。
试验所用挤出筛孔的直径为0.5mm，所得微丸利用标准筛筛选，保留32～40 目的微丸( 平均粒径为450μm) 备用。
2.4 1缓释微丸的制备
2.4.1 包衣参数
工艺参数如下：喷枪直径0.8mm，风机频率26.52Hz，进风量130m3/h，物料温度28℃，进风温度31℃，供液泵转速1～2r/min，雾化压力0.18MPa。由于Eudragit NE30D的成膜温度为5℃，在包衣过程中对温度特别敏感，因此保持包衣温度在28～28.5℃。包衣过程中供液泵转速2r/min 维持10min，然后降为1r/min，维持5min，再升至2r/min，按上述时间循环，直至包衣结束。包衣完毕后，立刻取出包衣微丸，称重，然后向其中撒入适量滑石粉，于35℃烘箱中老化24h。
包衣液处方中滑石粉的用量为Eudragit NE30D固含物( 即包衣材料干重) 的100％，不添加增塑剂，配制成总固含物为25％的包衣混悬液。
2.4.2 包衣增重
取“2.4.1”项下的包衣液对同一批含药丸芯进行包衣，以1 参比制剂为对照，分别考察包衣增重为13％、27％和35％时微丸的释放情况。结果如图1 所示，随着增重增加，释放速率降低，当增重13％时释放较快，Q2h 即达到60％，此时与1 参比制剂释放曲线的相似因子(f2) 值为43 ；而增重为35％时Q8h仅为60％，释放稍慢，f2值为54 ；增重27％时，Q8h为71％，且此时的f2值最高，可达62，故选择为包衣增重为27％。
2.4.3 滑石粉用量的筛选
本验选用超细(1000目) 滑石粉，既作抗黏剂，又作致孔剂。由于滑石粉不溶于水，包衣后在缓释衣膜中以细小快状存在，互相聚集而形成一定的方状结构( 见图2 圈出处)，并不会完全贴覆在微丸的表面，因此会有不规则通道形成，起到致孔剂的作用。
但滑石粉用量与其致孔作用并非成正比关系(见图3)。滑石粉用量降低至75％时，释放速率显著增加；当用量达125％时，释放结果基本与100％时保持一致，但在包衣过程中会有大量的滑石粉沉积在管路中，导致包衣效率降低。因此，选用滑石粉的用量选为包衣材料干重的100％。
2.4.4 老化时间对1 缓释微丸释放的影响
Eudragit NE30D 形成的包衣膜老化温度不能超过40℃，否则会引起反效果。并且包衣后所形成的微丸表面较黏，静电大，微丸会互相聚集，故老化时需要加入适量滑石粉，混合后于35℃进行老化，根据释放结果筛选老化时间。结果显示微丸老化12h时释放速率偏快，老化24和48h时释放曲线基本一致( 图4)，说明此时缓释微丸老化完全，缓释衣膜结构稳定。因此1 缓释微丸的老化时间可控制在24～48h。
2.4.5 包衣微丸工艺验证
取1(50 mg)、MCC 101(75 mg) 和一水乳糖(125 mg)，照“2.3”项下挤出滚圆法制备含药微丸，然后依据上述的微丸包衣工艺参数进行包衣，得到增重27％的包衣微丸。重复进行3 次试验，考察每批1 含量。结果含量为(50±0.8)mg，RSD 为0.67％，
显示3 批次重复性较好，释放以及含量均没有显著性差异，3 批制品与1 参比制剂释放曲线的f2 值分别为54、60 和58。
2.5 1缓释微丸片的制备
2.5.1 微丸和缓冲辅料比例的选择
1 缓释微丸进行压片时，需要添加适量的缓冲辅料来减小压力对微丸缓释衣膜的破坏，MCC 是其中较为理想的1 种稀释剂。微丸和填充辅料的比例可直接影响微丸片的体外释放行为，一般辅料所占比例越小，微丸就越多地暴露于粉体表面，增加压力破坏缓释衣膜的几率。若缓冲辅料所占比例过高，则会增加压片难度，造成片重过高或难以成型的问题。优化二者比例是微丸压片技术的关键参数，因此设计了以下2 种比例，即1 缓释微丸∶缓冲辅料(1∶1的乳糖和MCC101混合物) 为5∶5和4∶6。照设计比例将二者混合，加入适量的5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30 溶液，过18目筛制粒，于35℃干燥30min，过18 目筛整粒，加入1％硬脂酸后压片，单冲压力为11.5～13.5kN。
结果表明，当缓释微丸∶缓冲辅料比例为4∶6时，所压成的片剂与缓释微丸显示出了更高的相似性(图5)，说明此种比例下缓释辅料对微丸衣膜保护作用较好，而另一比例则达不到理想的保护效果，会造成衣膜的破裂，释放速度加快，故确定微丸∶辅料的最终比例为4∶6。
2.5.2 不同润滑剂的选择
参照“2.5.1”工艺，压片前分别以1％的硬脂酸或硬脂酸镁作润滑剂，考察所得片剂的硬度，结果见图6。可见，以1％硬脂酸镁为润滑剂，压片压力为18～19kN 时，片剂的硬度为5kg；而以1％硬脂酸为润滑剂在11kN 压力下压片，即可得到硬度合适(5.5kg) 的片剂。微丸压片技术的关键在于在低压力下即可形成高硬度的片剂，故选择1％硬脂酸作润滑剂。
2.5.3 不同工艺和压力的选择
本试验设计了3 种工艺：①将微丸和大粒径、堆密度较小的缓冲辅料(MCC PH200) 相混合后加入润滑剂直接压片；②将缓冲辅料( 1∶1的乳糖和MCC PH200 混合物) 混匀后湿法制粒，从所得颗粒中筛分出与微丸大小、堆密度相近的颗粒，再将微丸和辅料颗粒混合，加入润滑剂后压片；③将缓冲辅料(1∶1的乳糖和MCC 101 混合物) 和微丸混合后，加入适量黏合剂，湿法制粒，直接将辅料包覆在微丸表面，然后加入润滑剂，压片。取未压片的缓释微丸、不同工艺制备的片剂进行扫描电镜观察。结果见图7。
结果表明，未压片的缓释微丸较圆整，且微丸切面可明显观察到缓释材料在微丸的表面形成了一层均匀致密的包衣层(图7b)。工艺①所得片剂中微丸表面并不会附着颗粒，较光滑，因此可直接看到微丸以较完整的状态存在( 图7c、d)。工艺③所得片剂的SEM 照片中可见，辅料在PVP K30 的黏合作用下包裹在微丸的表面，没有观察到微丸的状态(图7e、f)。
在一定压力下(≤13kN) 压制不同硬度(工艺①：6和12kg ；工艺②：4 和6 kg；工艺③：4和6kg) 的1 缓释微丸型片剂，并考察其体外释放情况，结果见图8。工艺①和工艺②所得的缓释微丸型片剂的释放在片剂硬度较大时增加，说明单冲压力直接作用于微丸上，并且随着压力增加对微丸包衣膜的破坏增加；采用工艺③时，压力较大的制品释放降低，是因为微丸表面有大量的辅料贴敷，可以降低部分压力对微丸的破坏，并且在一定的压力范围内(≤13kN) 随着压力增加，可使微丸外层的辅料层更加致密，且此时微丸尚在形变范围内的平衡状态。故选用工艺③进行压片。
分别用零级、一级和Higuchi 模型拟合缓释微丸型片剂( 即工艺③制备的硬度为6kg 的片剂) 的体外药物释放数据，结果表明其释药行为用Higuchi 方程拟合效果最好，R2=0.996 16。
2.6 家兔体内药动学评价
2.6.1 1血药浓度测定条件
色谱条件：色谱柱 C18柱(4.6mm×200mm，5μm) ；流动相47％甲醇；检测波长 288 nm ；流速1.0 ml/min ；柱温40 ℃ ；进样量20 μl。
血浆预处理方法：将所取全血置肝素化试管，离心(890×g)10min，精密吸取血浆200μl 置2ml离心管中，精密加入乙腈600μl，涡旋混匀后离心(890×g)10 min，吸取上清液至干净离心管内，氮气吹干，残留物用流动相20 μl 复溶，样品离心(6 562.5×g)10 min，取上清液进样测定。
此色谱条件下，其萃取回收率平均为77.45％，方法回收率为80.50％，1 浓度c 在12.5 ～ 200 ng/ml范围内与峰面积A 线性关系良好，回归方程A=0.1068c+4.577 2，R²=0.992 3。
2.6.2 药动学研究
普通片的制备：1、乳糖、MCC 101 和胶态二氧化硅适量，采用粉末直压法制备规格15mg的普通片。
取家兔6只，随机分成2组，给药前禁食12h，不禁水。两组家兔分别口服单剂量给予1 普通片1片(15 mg) 与1 缓释微丸片( 采用工艺③，同比例缩小其规格至15mg，硬度为6kg)1 片。于给药前以及给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12和24 h 于耳缘静脉取血0.6 ml，置肝素化试管，按照上述预处理方法进行后续处理。
2.6.3 药动学试验结果
药- 时曲线见图9，可见1 普通片的血药浓度“峰谷”波动过程较1 缓释微丸片大，而缓释微丸片能够较长时间维持平稳血药浓度，缓释效果良好，采用PKSolver2.0 药动学软件分析，主要药动学参数见表1。结果表明，1 缓释微丸片不但增加了其半衰期，也提高了生物利用度。
3 讨论
3.1 国外已有多种药物的多单元缓释微丸片上市，如酒石酸美托洛尔缓释多单元制剂(Beloc-ZokTM，规格50 mg) 和奥美拉唑多单元微丸系统(AntraTMMUDS，规格20 mg)，但国内尚未有此种剂型上市。本研究选用1 为模型药物制备多单元缓释微丸片。制备微丸的粒径越小，单个小丸芯在压片时受到的压力随之越低，可以减小压力对微丸的破坏。本研究制备了粒径450μm 的含药微丸，观察到用淀粉做填充剂时难以制备软材，MCC 与乳糖混用后得到改善，并用5％PVP K30为黏合剂，可满足包衣和压片需求 。
3.2 选择纯化水和0.05mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.8) 为体外释放介质，考察不同释放介质对1 缓释微丸释放的影响。结果显示其在这2 种介质中的释放行为无显著性差异，考虑到操作性，纯化水较为高效快捷，因此选用纯化水作释放介质。设定转速为50、75 和100 r/min，模拟不同程度胃肠道蠕动情况，测定1 缓释微丸在不同搅拌速度下的药物释放曲线。结果显示转速对1 缓释微丸释放的影响较小，根据推荐原则并结合文献资料，最终选用(50±1)r/min 作为释放测定时的转速。
3.3 制备缓释微丸时，为了保证微丸具有一定的形变能力，需要选择延展性较好的包衣材料。普通缓控释包衣材料如乙基纤维素类，如Surelease 等水分散体，延展性较低，而Eudragit L30D55中即使增加TEC的用量，其缓释作用也不显著。最终选择Eudragit NE30D，其在不加增塑剂的情况下延展系数为365％。由于Eudragit NE30D的成膜温度为5℃，黏度高，因此加入同比例的滑石粉做抗黏剂避免包衣过程中的结团以及静电吸附现象，并且包衣过程中要严格控制流化床的各个温度参数，尤其是物料温度，本研究中最终通过控制流
速1 r/min(5min)、2 r/min(10min) 的交替方式使其平衡在28～28.5℃。
3.4 文献中关于微丸型片剂的制备方法多选用直压的方式，但本试验中考察了3 种工艺，SEM结果显示，直压下，可以看到微丸存在的状态，但是此时释放稍快，可知微丸有少量破损；而采用湿法制粒后，电镜视野范围内几乎全部被颗粒覆盖，结合释放结果，可推测此时微丸应完整存在，且被颗粒包裹，此外该微丸在0～13kN 范围内仍具有形变能力，故此时的释放与未压缓释微丸最为相似。
3.5 为了保证缓释微丸片的吸收，家兔试验时固定其四肢和头部后，用工具将其舌头卷出，放入药片至咽喉处，用送药器轻轻向胃内输送，必要时可使其服用少量水，以避免因动物易动所致的吐出片剂现象。
参考文献：略
作者简介：乔晓芳，女，硕士，从事药物制剂的研究和新药评审工作。
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