近期基因疗法研究进展一览

（作者：dingka  来源：生物谷）

本期为大家带来的是基因疗法用于治疗多种疾病的最新研究进展，希望读者朋友们能够喜欢。

1. PLoS Pathog：利用CRISPR/Cas9培育出抵抗病毒感染的基因编辑猪

doi:10.1371/journal.ppat.1006206.

在一项新的研究中，来自英国爱丁堡大学、皮尔布赖特研究所和Genus公司（Genus plc）的研究人员培育出基因编辑猪。这些猪可能免受一种每年导致养猪业损失数十亿欧元的病毒感染。相关研究结果于2017年2月23日发表在PLoS Pathogens期刊上，论文标题为"Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function"。

这些基因编辑猪是这些研究人员利用先进的基因编辑技术培育出的。它们潜在地抵抗猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）。PRRS是由一种病毒导致的，因此，该病毒被称作为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus, PRRSV）。

初步的测试结果揭示出来自这些基因编辑猪的细胞完全抵抗导致这种疾病的两种主要的PRRSV基因型感染。

这些研究人员说，这些猪在其他方面都是健康的，而且利用基因编辑技术在它们体内导入的变化应当不会影响它们抵抗其他感染的能力。

PRRS导致幼猪出现严重的呼吸问题，导致怀孕的雌猪繁殖失败。

已有研究证实PRRSV靶向被称作为巨噬细胞的免疫细胞。这些细胞表面上的CD163分子在能够让PRRSV建立感染中发挥着关键性的作用。

这些研究人员利用基因编辑工具CRISPR/Cas9切除猪DNA中的CD163基因的一小部分。

利用来自这些CD163基因发生修饰的基因编辑猪的细胞开展实验室测试，结果证实这些猪的DNA发生的变化阻断PRRSV的感染能力。

这项研究的下一个阶段将是测试当这些基因编辑猪接触PRRSV时，它们是否抵抗PRRSV感染。

另一个研究团队在之前的研究中培育出完全不产生CD163分子的猪，而且当这些猪接触PRRSV时，它们不会患病。

在这项新的研究中，CD163中仅与PRRSV相互作用的部分被移除，因而这种分子似乎保持它的其他功能。

在全世界的大多数养猪的国家中，PRRS是地方性流行病。疫苗大多数不会阻止PRRSV扩散，而且这种病毒持续快速地发生进化。因此，如今，它是养猪者面临的最大挑战之一。单就欧洲而言，据估计，这种疾病每年导致养猪业损失15亿多欧元。

论文通信作者、爱丁堡大学罗斯林研究所的Alan Archibald教授说，"这种基因组编辑技术通过降低因传染病造成的浪费和损失有助提高食品安全性，而且还通过降低疾病负担有助提高动物福利。我们的结果让我们在朝实现这些益处和专门解决全世界养猪业这个最为重要的传染病问题的目标上更接近一步。"

Genus公司首席科学家Jonathan Lightner说，"这些结果进一步展示了CD163在阻止PRRSV感染中的至关重要性，而且证实靶向移除CD163中的病毒相互作用结构域能够导致抵抗性产生，与此同时，这种蛋白的其余部分仍然保持存在。当Genus公司加快开发基因编辑技术来产生PRRSV抵抗性时，这种针对CD163基因的编辑，和针对其他基因的编辑将会接受评估。Genus公司致力于开创性地将这种技术应用于动物遗传改良中以便改善动物的健康、农户的生存状态和为不断增加的全球人口可持续地生产食物。"

2. Nat Commun：科学家应用迄今最小的Cas9基因剪刀治疗眼疾

来自韩国的科学家利用工程技术开发出了迄今最小的CRISPR-Cas9，并通过腺相关病毒（AAV）运载到小鼠的肌细胞和眼部，用以修饰引起失明的一个基因。相关研究结果发表在国际学术期刊Natue Communications上。

这套CRISPR-Cas9系统有望成为治疗常见且无法进行药物治疗的疾病的新治疗工具。

CRISPR-Cas9是一种新型廉价且精确的基因编辑工具。Cas9是一个"基因剪刀"蛋白：能够在引导RNA的指引下定位切割靶基因。为了帮助CRISPR-Cas9到达靶标DNA，需要通过质粒或病毒进行运载。AAV是一种高效安全的载体能够在体内进行基因表达，广泛用于基因治疗。

最常见的CRISPR-Cas9技术所使用的Cas9来自于化脓性链球菌，但是这种Cas9蛋白包含1368个氨基酸，无法通过AAV进行包装和运载。还有一种来自金黄色葡萄球菌的Cas9也可以用于基因编辑，虽然只有1053个氨基酸可以通过AAV进行运载但是这样就没有足够空间用来装载其他蛋白。

在这项研究中，研究人员发现CjCas9既有效又足够小，只有984个氨基酸组成，可以和超过一条引导RNA以及一个荧光报告蛋白一起包装进AAV里。研究人员又对这项技术的一些方面进行了优化。随后他们将新的CRISPR-Cas9系统包装到AAV里，同时还有两条引导RNA和一个荧光报告蛋白，用来对小鼠肌肉和眼部的基因进行突变。他们选择了两个参与衰老相关黄斑变性的基因，这种疾病会导致成年人失明。

其中一个基因是治疗该疾病的一个常见靶点，叫做VEGF A，另外一个是能够激活VEGF A基因转录的转录因子HIF-1a。在这项研究中，研究人员证明通过AAV运载到视网膜的CjCas9能够有效抑制小鼠Hif1a和VEGF A基因的激活，减少脉络膜新血管形成的面积。

眼内注射AAV包装的CRISPR-CjCas9还可以用于治疗其他视网膜疾病和系统性疾病。CjCas9具有高度特异性不会脱靶引起基因组产生其他突变。

3. Cell：科学家发现新型基因突变 为癌症诊断和治疗提供思路

威尔康奈尔医学院和纽约基因组中心的一项最新研究在癌细胞内发现了一种新的基因突变类型，或为了解癌症起源提供线索，同时也为开发新的治疗方法提供靶点。

借助下一代基因测序技术，科学家们已经知道癌症的根源在于破坏蛋白质序列的突变。突变会导致细胞合成异常活跃或发生功能紊乱的蛋白，也会导致细胞无法合成一些蛋白，最终导致癌症的发生。在最近发表在Cell上的这项研究中，研究人员介绍了一种可能导致癌症发生的新型突变：在基因组的非编码区域发生微小DNA序列（1到50个碱基）的插入或缺失，也叫做"indels"。

"这些非编码区域也有重要作用，因为它们包含了一些能够影响基因调控的序列。我们已经知道这些区域有非常重要的生物学意义，问题在于这些区域如何影响癌症发育。"文章作者Dr. Marcin Imielinski教授这样说道。

在这项研究中，研究人员对几个公共数据库中肿瘤样本的基因序列信息进行了分析，着重研究基因组中占98%的非蛋白编码区域。他们从肺腺癌这种最常见的肺癌开始，发现这些样本的基因组中最常见的indel突变区域位于编码表面活性蛋白的基因中。

之前没有研究将这些对健康肺功能非常重要的基因与肺癌联系在一起。但是它们在发展为肺腺癌的细胞类型中存在高水平特异性的表达。

研究人员还对12种其他类型癌症的基因组进行分析，发现在肝脏、胃和甲状腺肿瘤中存在类似的模式。

"在每一种癌症中，非编码的indel突变都会聚集在对器官功能非常重要的基因上，但是这些基因之前都未与癌症联系在一起。"Imielinski教授表示。这些非编码的indel突变非常常见，20%~50%的相关癌症中都存在这种突变。

"这种突变发生的频率与最著名的致癌突变一样高，任何基因或序列以这种频率发生突变都可能导致癌症发生。如果我们可以证明这一点，那将会是令人感到非常兴奋的结果。"

"这些突变可以用作生物标志物帮助我们进行癌症的早期诊断，或者当存在转移灶无法定位原发灶的时候可以用于指示原发灶。这项研究的发现可以有许多可能的临床应用。"

4. NEJM：基因疗法可有效治疗镰刀型红细胞贫血症

最近研究者们发现一种新的基因疗法，能够有效治疗镰刀型红细胞贫血症。

虽然这一疗法仅仅在一名法国青少年身上成功实现，但这一手术释放了一个非常积极的早期信号，或许能够推广给数百万名患有该种疾病的患者。

镰刀型红细胞贫血症是由红细胞中血红蛋白的产生出现问题导致的红细胞变形的症状。这一微小的改变会导致红细胞失去弹性，从椭圆状变为镰刀型。这一改变会使得细胞难以通过狭窄的血管，从而提高细胞堆积堵塞血管的风险。

不过，科学家们通过病毒转染的方式将正常的血红蛋白基因转入这名患者的骨髓细胞中并将其回输到患者体内。经过15个月的治疗，患者的健康水平得到了大幅上升，已经可以不依赖药物治疗。虽然现在就说得到了治愈还为时尚早，但作为前期的探索性治疗，这一病例已经取得了巨大的成功。

镰刀型红细胞贫血症会导致局部缺血，即由于氧气无法运输到特定部位而导致疼痛、器官损伤甚至死亡。

目前有效的疗法只有骨髓移植，但这一疗法不仅风险高，而且手术十分困难，并不是所有人都适用。由于该种疾病是因为血红蛋白基因的一个核苷酸发生突变引起的，因此理论上通过基因疗法扭转这一突变的影响后就能够得到治愈。

根据医生们的报道，这名患者体内的红细胞已经半数恢复正常，在三个月之内都没有接受血液回输的治疗。

当然，这一疗法离最终的普及还有很长的路要走，但这已经这一疾病的治疗方面巨大的进步了。

相关结果发表在《New England Journal of Medicine》杂志上。

5. Nat Biotechnol：新型基因编辑策略或有望攻克癌症

doi:10.1038/nbt.3843

最近，一项刊登在国际杂志Nature Biotechnology上的研究报告中，来自匹兹堡大学医学院的研究人员通过研究利用CRISPR基因编辑技术开发出了一种新型的基因疗法，这种基因疗法能够有效靶向作用促癌"融合基因"，并且改善恶性肝癌和前列腺癌小鼠模型的生存率。

研究者Jian-Hua Luo表示，这项研究中我们首次利用基因编辑技术特异性地靶向作用癌症融合基因，这也为后期我们开发治疗癌症的新型疗法提供了一定线索。融合基因通常和癌症发病相关，当先前分离的基因结合在一起候就会形成融合基因，随后融合基因就会产生一种异常蛋白诱发癌症发生。

此前研究人员鉴别出了诱发前列腺癌复发和恶性前列腺癌的一组融合基因，在Gastroenterology杂志上发表的一篇研究报告中，研究者Luo及其同事在多种类型的癌症中发现了一种名为MAN2A1-FER的融合基因，包括肝癌、肺癌和卵巢癌等，该基因主要会诱发肿瘤快速生长以及侵袭性的发生。

当前研究中，研究人员成功利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向作用融合基因所形成的特殊DNA序列，研究者利用病毒来运输基因编辑工具，对融合基因中的突变DNA进行切割，同时以能够诱发癌细胞死亡的基因替换突变的DNA，由于融合基因仅在癌细胞中存在，因此基因疗法就具有高度的特异性，当基因疗法进入临床试验后其往往也会带来更少的副作用。

研究人员利用接受人类前列腺癌细胞和肝癌细胞移植物的小鼠模型进行研究，对癌症融合基因进行编辑能够使得肿瘤尺寸降低30%，在为期8周的观察性研究中，并没有小鼠表现出任何癌症转移迹象，所有小鼠均存活。相比较而言，在利用病毒治疗切除另外一种并非在肿瘤中存在的融合基因的对照小鼠中，肿瘤尺寸增加了将近40倍，而且大部分动物机体中都观察到了癌症转移，在实验结束之前所有的动物都死亡了。

这项研究中研究者阐明了另外一种能够有效抵御癌症的新型疗法，研究者Luo说道，其它类型的癌症疗法能够靶向作用步兵部队，而我们的方法是靶向作用指挥中心，因此这种新方法并不会给癌细胞大部队重新反击的机会。此外，这种新型癌症疗法由于传统癌症疗法的一点就在于其适应性较好，诱发标准化疗无效的常见问题就是癌细胞会产生新型突变对疗法耐药，利用基因编辑技术，研究人员就能够对新型突变进行靶向作用来抵御疾病的产生和复发。

未来，研究人员将会通过更为深入的研究来检测是否这种新型策略能够完全消除疾病，而不是诱导患者疾病出现部分缓解。

6. Sci Adv：特殊腺病毒亚型或有望帮助开发治疗多种疾病的靶向基因疗法

DOI: 10.1126/sciadv.1602670

为了进行复制，病毒似乎已经非常擅长利用人类细胞来制造病毒蛋白了，这也就是为何科学家们一直会利用病毒来将有用的基因运输到人类细胞中来帮助缺失重要蛋白或酶类的患者进行疾病治疗的原因了。近日来自斯克利普斯研究所的研究人员通过研究揭开了一种关键的结构细节，或有望让病毒作为一种更好的工具帮助科学家们开发治疗多种人类疾病的新型疗法。

相关研究刊登于国际杂志Science Advances上，研究者表示，并不太流行的D型腺病毒的特殊结构或许能够作为一种良好的基因运输载体，因为这种结构并不太会使得病毒离开肝脏，从而就大大降低了对肝脏的毒性作用；这项研究中研究人员首次揭示了D型腺病毒表面的结构细节，这种特殊结构就将该类病毒同普遍存在的C型腺病毒有效区分开来了。

研究者Vijay Reddy说道，对不同种的腺病毒结构的理解或能帮助我们开发更好的基因疗法或疫苗载体；利用名为低温电子显微检查技术，研究人员发现，当两个种的腺病毒共享相同的壳状核心结构时，其或者有着不同的表面结构，研究者将其称之为"装饰品"或"环状结构"。这些环状结构时病毒行为产生的关键，其能够确定病毒能同人类细胞表面哪种受体相结合，对于C型腺病毒而言，特殊的环状结构能够帮助病毒吸附到血液凝固因子（衔接蛋白）上，而且还能够靶向获得肝脏目标；而特殊的D型腺病毒则会表现出完全不同的"环状装饰品结构"，当用于基因和疫苗疗法时，这种病毒就能够运输有用的基因。

此外，相比C型腺病毒而言，D型腺病毒还有更多重要的优势，人类往往会持续暴露于C型腺病毒中，因此大部分人机体中都会产生抵御这类病毒的抗体，相同的抗体即使在用作开发有益疗法时，其也会抵御C类腺病毒，从另一方面来讲，很多D型腺病毒非常罕见，而且患者机体也不太可能产生抵御这类病毒的抗体，这就使得这类病毒能够更好地作为开发运输疗法的病毒，实际上，目前研究人员正在进行测试利用这类病毒开发疟疾和埃博拉病毒的疫苗。

下一步研究人员计划对腺病毒的其它5个种进行深入研究来阐明是否这些腺病毒亚型也存在一些有用的特点作为病毒疗法的载体。

7. 基因疗法或可降低血脂与胆固醇

最近，来自宾夕法尼亚大学医学院的研究者们进行的两项研究表明，通过注射抗体，能够降低血液中的脂肪含量，进一步缓解由动脉壁上沉积的脂肪、胆固醇等物质引起多的冠状动脉硬化的症状。

这项新型的技术靶向的是一类叫做ANGPTL3的蛋白质，该蛋白能够调节清除血液中甘油三酯的酶的活性。近年来的一些研究显示ANGPTL3的基因突变能够降低血液中甘油三酯、LDL胆固醇以及HDL胆固醇的水平。

根据最近发表在《新英格兰医学杂志》上的一篇文章，研究者们通过对小鼠以及人体的ANGPTL3蛋白进行研究，发现通过注射抗体（evinacumab）的方式抑制ANGPTL3的活性能够降低患者体内76%的甘油三酯的水平以及23%的胆固醇的水平，小鼠模型也证明该疗法能够缓解动脉硬化的症状。

研究者们还对188000名参与者进行了遗传学检测，结果显示携带ANPGTL3突变的个体相比对照组患冠心病的几率要低40%左右。

"在临床治疗中，我往往会遇到许多甘油三酯水平很高的患者，但目前的的治疗手段都无法有效地降低甘油三酯的水平"，该研究的共同作者，来自医学院的心血管医学助理教授Richard L. Dunbar博士说道。"这一发现告诉我们ANGPTL3的突变与高血脂之间存在一定的因果关系，或许这可以成为可用的治疗手段"。

在另外一项研究中，研究者们通过小鼠与人体试验发现了相同的现象，在这一试验中，写道ANGPTL3突变的人群患冠心病的几率相比对照组要低34%。

8. JCI insight：基因疗法可以消除哮喘症状

doi:10.1172/jci.insight.85742

科学家们目前成功地利用基因疗法"关闭"了引发哮喘的免疫反应，他们希望这一技术能够应用于治疗其它严重的过敏反应，例如花生、蜂毒、甲壳类动物。

这项研究目前在动物水平获得了成功，能够消除引发过敏反应的免疫细胞的记忆，如果该结果能够在人体试验中取得成功，那么将会对过敏症状的患者带来福音。

"对于哮喘以及过敏反应的治疗来讲最严重的挑战在于免疫细胞，主要是T细胞，会形成免疫记忆，从而变得难以治疗"。该研究的首席作者，来自澳大利亚昆士兰大学的Ray Steptoe说道："如今我们成功地利用基因疗法消除了T细胞的相关记忆，从而能够降低这些细胞对过敏原的敏感程度"。

过敏反应是指免疫系统对正常情况下无害的物质产生过激的反应的现象，但人们暴露于过敏原的环境下时，将会出现一系列的症状，包括眼镜发痒，流鼻涕，在严重的情况下还会导致死亡。

虽然此前的研究能够利用纳米颗粒将过敏原物质"伪装"从而通过免疫系统的审查，但目前来讲最有效的治疗手段就是尽量不让患者接触已知的过敏原。为了寻找更加有效的方式，研究者们提取了经过遗传修饰的小鼠的骨髓细胞（该小鼠对于黑麦花粉不再具有过敏活性），并将其注入野生小鼠体内。结果显示，这一做法能够成功地抑制受体小鼠相关过敏反应的发生。

尽管该研究仅仅以哮喘作为研究对象，但研究者们希望能够应用于其它的过敏反应，例如食物过敏等等。

相关结果发表在《JCI Insight》杂志上。

9. Nature：重大突破！利用靶向KRAS突变基因的外泌体治疗胰腺癌

doi:10.1038/nature22341

外泌体（exosome）是所有细胞释放出的病毒大小的颗粒。它们天然地存在于血液中。根据来自美国德州大学MD安德森癌症中心的一项新的研究，对外泌体进行基因操纵可能提供一种新的胰腺癌治疗方法。相关研究结果于2017年6月7日在线发表在Nature期刊上，论文标题为"Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer"。论文通信作者为德州大学MD安德森癌症中心癌症生物学系研究员Raghu Kalluri博士。

德州大学MD安德森癌症中心的早期研究已证实外泌体可被用来检测胰腺癌，但是这些最新的发现揭示出作为一种潜在新的疗法，经过基因改造的外泌体可被用来直接地和特异性地靶向经常与胰腺癌相关的KRAS突变基因。

在这项新的研究中，经过基因修饰的外泌体（被称作iExosome）能够运送特异性地靶向KRAS突变基因的小RNA分子，从而导致胰腺癌模式小鼠病情缓解，增加它们的总存活率。这些研究人员采用了一种被称作RNA干扰（RNAi）的靶向方法：利用这些天然的纳米颗粒（即外泌体）运送小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）分子来靶向胰腺癌细胞中的KRAS突变基因，从而影响多种胰腺癌模型的肿瘤负荷和存活。他们证实外泌体能够作为一种高效的RNAi载体发挥作用，这是因为这些纳米大小的囊泡（即外泌体）轻松地在体内迁移和进入靶细胞（包括癌细胞）中。

作为一种分子通断开关的KRAS发生突变时会处于"开启"状态。在80%～95%的胰腺导管腺癌（PDAC）当中，这个基因发生突变，这也是这种癌症中最为常见的突变。这些研究人员证实iExosome能够运送特异性地靶向KRAS的siRNA和shRNA分子，并且比他们的合成对应物脂质体（liposome）更加高效。脂质体不具有外泌体表现出的天然复杂性和优势。

德州大学MD安德森癌症中心癌症生物学助理教授Valerie LeBleu博士说，"我们的研究提示着与脂质体相比，外泌体表现出运送siRNA分子和抑制侵袭性胰腺瘤生长的优异能力。我们也证实外泌体表面上的CD47存在允许它们躲避来自循环单核细胞的吞噬作用。"

CD47是一种参与很多细胞过程（包括细胞死亡、生长和迁移）的蛋白。吞噬作用是被称作巨噬细胞的白细胞用来消化细胞碎片、外源异物和颗粒的一种过程。单核细胞是最大类型的白细胞，也具有吞噬作用，并且在免疫细胞中发挥着重要作用。

德州大学MD安德森癌症中心癌症生物学系实习生Sushrut Kamerkar博士说，"从根本上说，CD47发起一种'不要吃我'的信号来抑制吞噬作用。我们鉴定出CD47如何阻止外泌体在血液循环中被清除，并且促进将它们运送到胰腺癌细胞中。"

尽管采用当前的标准疗法，PDAC患者的预后是较差的，因而有效的新疗法是迫切需要的。对PDAC开展的基因分析表明KRAS基因突变在绝大多数患者体内发生，并且在癌症起始、进展和转移中发挥着显著的作用。尽管存在其他的基因缺陷，在小鼠体内利用基因操纵抑制致癌的KRAS基因会阻止肿瘤进展。在此之前，开发一种直接的特异性地靶向KRAS的方法是遥不可及的。

这些研究人员也证实一种被称作巨胞饮（macropinocytosis）的细胞过程促进发生KRAS基因突变的癌细胞摄取外泌体。巨胞饮参与细胞清除营养物和囊泡。

Kamerkar说，"与之前的发现相一致的，由于增加的巨胞饮过程，达到胰腺的外泌体数量增加可能为外泌体进入KRAS相关的癌细胞提供进一步的优势。尽管胰腺瘤存在致密的基质，我们的结果也支持癌细胞高效地摄取iExosome。还需开展进一步的研究以便更好地理解通过巨胞饮进入细胞中的外泌体是否具有其他的可能增强它们的抗肿瘤能力的特征。"

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